【摘要】 目的 研究膀胱癌中BLU基因启动子甲基化状态、转录水平及其意义。方法 采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR, MSP)技术和逆转录PCR(RTPCR)技术分别检测54例膀胱癌患者癌组织及45例相应癌周正常组织、3例非肿瘤患者的正常膀胱组织中BLU基因启动子甲基化状态和转录水平。结果 ①31.5%(17/54) 膀胱癌组织中BLU基因高甲基化，相应癌周正常组织和3例正常膀胱组织均未发现该基因高甲基化改变；②甲基化状态与膀胱癌临床病理参数无明显相关性；③在45例膀胱癌组织中，BLU表达缺失率为42.2%(19/45)；④BLU mRNA表达缺失与肿瘤临床分期和病理分级相关(P<0.05)；⑤在启动子高甲基化的膀胱癌中，92.3%(12/13)BLU mRNA表达异常下调或缺失。结论 膀胱癌中频繁发生BLU基因的高甲基化和mRNA表达缺失，其高甲基化可能是基因转录失活的重要原因。

【关键词】 膀胱癌；BLU；甲基化；转录；甲基化特异性PCR

Promoter hypermethylation and transcription level of BLU in bladder cancer

Zhang Jianying, Li Zhi, Yu Yongchun, Duan Jianmin

(Department of Central Laboratory, Tenth Peoples Hospital, Tongji University, Shanghai 200072;The Second Hospital Affiliated to Lanzhou University, Lanzhou 730030, China)

ABSTRACT: Objective To investigate the promoter methylation status and the transcription level of BLU in bladder carcinoma and their significance. Methods The methylation status of promoter and the transcription level of BLU were examined by methylation specific PCR (MSP) and RTPCR in bladder cancer tissues from 54 patients, adjacent normal tissues from 45 cases and normal bladder tissues from 3 noncancerous patients. Results ① 31.5%(17/54) bladder cancer tissues showed BLU hypermethylation; neither the paired adjacent normal tissues nor the three normal bladder tissues showed BLU hypermethylation. ② There was no significant correlation between the methylation status and the clinical pathological parameters in bladder cancer. ③ The expression of BLU was absent in 42.2% (19/45) of bladder carcinoma from cystectomy. ④ Loss of BLU expression was associated with the stage and grade of the tumor (P<0.05). ⑤ The expression of BLU mRNA was abnormally downregulated or absent in 92.3% (12/13) of bladder carcinoma tissues with promoter hypermethylation. Conclusion BLU was found frequently hypermethylated and absent of mRNA expression in bladder carcinoma. Hypermethylation of BLU may contribute to its transcription inactivation.

KEY WORDS: bladder cancer; BLU; methylation; transcription; methylation specific PCR (MSP)

肿瘤抑制基因启动子区CpG岛的高甲基化已被确立为基因转录失活的一种重要机制[1]。膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,近年来的研究发现，包括p16、Ecadherin、VHL、RASSF1A等在内的多种肿瘤抑制基因在膀胱癌中均表现出不同程度的甲基化改变[24]。BLU基因是新发现的一个肿瘤候选抑制基因[5]，其编码蛋白含有一个DNA结合功能域——MYND功能域。该功能域同样位于AML/ETO、BS69以及suppression等蛋白内，这些蛋白分别在转录抑制、肿瘤细胞生长抑制以及细胞周期调控等方面发挥作用，研究证实完整的MYND功能域对这些蛋白功能的发挥是必须的，推测BLU分子可能具有与其他同源蛋白类似的细胞生长负调控功能，并参与了重要的转录调节途径[6]。本研究通过检测BLU基因在膀胱癌中的甲基化状态和转录水平，以期为膀胱癌甲基化谱增加一名新成员，并探讨该基因在膀胱癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2002-2004年期间收集的45例膀胱移行细胞癌患者行膀胱切除术切除的癌组织及相应的癌周正常组织，男36例，女9例，年龄30-83岁，平均64岁；9例膀胱移行细胞癌患者经尿道切除的癌组织，男8例，女1例，年龄59岁；3例非肿瘤患者手术切除的正常膀胱组织。标本由同济大学附属第十人民医院、兰州大学第二附属医院和上海市第一人民医院分院泌尿外科提供。膀胱切除术切除的膀胱癌组织标本病理分级按WHO方法：Ⅰ级27例，Ⅱ级11例，Ⅲ级7例；临床分期按UICC标准：Ta-T1期31例，T2-T3期14例。经尿道切除的膀胱癌组织标本病理分级均为Ⅰ级，临床分期均属Ta-T1期。

1.2 组织DNA的抽提 采用Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega 公司)从组织中抽提DNA，紫外分光光度仪定量。

1.3 组织RNA的抽提 严格按照TRIzol (Invitrogen公司)试剂盒说明书提取组织总RNA，并根据A260值计算出RNA浓度，以A260/A280值判定其纯度，利用DnaseⅠ去除含有的痕量DNA。

1.4 DNA的亚硫酸氢盐修饰和甲基化特异性PCR(MSP) 采用基因组DNA修饰试剂盒CpGenome DNA Modification Kit(Serelogical公司)，取1μg DNA按说明书操作步骤进行修饰。以修饰后DNA作为模板,分别利用甲基化和非甲基化特异性引物进行热启动PCR扩增。甲基化特异性引物为5′TTCGTGGGTTATAGTTCGAGAAAGCG3′(上游)和5′ AACGAATTAACCGCGCCTACGC3′(下游)；非甲基化特异性引物为5′TTTGTGGGTTATAGTTTGAGAAAGTG3′(上游)和5′ AACAAATTAACCACACCTACAC3′(下游)。反应条件按降落(touchdown)PCR程序进行：95℃ 12min；按94℃ 20s，72-67℃(甲基化引物)/66-61℃ (未甲基化引物)40s(每个循环退火温度依次降低1℃)，72℃ 20s进行6个循环，再按94℃ 20s，66℃(甲基化引物)/60℃(未甲基化引物)30s， 72℃ 30s进行30个循环；最后72℃ 5min。扩增片段长度均为157bp。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 MSP产物克隆和测序 随机挑选甲基化和未甲基化的两份MSP产物，TA克隆后进行测序，测序引物为M13通用引物，测序仪为ABI 377型测序仪。

1.6 RTPCR 严格按照Takara One Step RNAPCR Kit (AMV)说明书进行一步法RTPCR扩增，βactin为内参照。引物序列及扩增条件见表1。

表1 RTPCR引物序列及产物长度（略）

Table 1 RTPCR primers and the length of products

F: forward primer; R: reverse primer

1.7 琼脂糖凝胶电泳 取10μL扩增产物进行20g/L琼脂糖凝胶电泳，GIS凝胶图象处理系统分析结果。

1.8 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件包处理数据，进行χ2检验或四格表精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲基化状态的检测结果 31.5%(17/54)膀胱癌组织中发现BLU基因异常甲基化，其中28.9%(13/45) 膀胱切除术切除的癌组织标本中发现基因甲基化(图1A)，44.4%(4/9)经尿道切除癌组织标本中发现基因甲基化(图1B)。相应癌周正常组织和3例正常膀胱组织中均未发现该基因异常甲基化改变(图1A)。膀胱癌组织BLU基因甲基化与其临床病理特征的关系见表2。

图1 膀胱癌组织中BLU基因的MSP结果（略）

Fig.1 Methylation status of BLU gene in bladder cancer assayed by MSP

A: Methylation status of BLU gene in bladder cancer and adjacent normal tissues obtained by cystectomy; B: Methylation status of BLU gene in bladder tumor tissues obtained from transurethral surgeon; m: methylated; u: unmethylated; T: bladder tumor tissue; N: paired normal tissue; NB:normal bladder tissue; H2O: blank control; M: pUC Mix

表2 膀胱癌组织BLU基因甲基化与其临床病理特征的关系（略）

Table 2 Correlation between BLU gene methylation and the clinical parameters in bladder cancer

2.2 克隆测序的结果 结果显示：甲基化的MSP产物序列(图2)中，所有的胞嘧啶(C)均与鸟嘌呤(G)相连，且位于其5′端，即CpG岛中的胞嘧啶受甲基保护不发生转换；而未甲基化的MSP产物序列中的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)所替代，表明其经亚硫酸氢盐修饰后转换为尿嘧啶(U)，并在PCR过程中被扩增为胸腺嘧啶(T)，证实了MSP分析CpG岛甲基化状态的准确有效性。

图2 MSP产物测序图（略）

Fig.2 Examples of sequencing chromatography of MSP products

A: sequencing chromatography of methylated products;B: sequencing chromatography of unmethylated products

2.3 mRNA表达的检测结果 经RTPCR扩增所有组织中均可见βactin mRNA正常表达，3例正常膀胱组织以及所有癌周正常组织中均可见BLU表达。膀胱癌组织中，BLU mRNA表达缺失率(包括表达异常下调和缺失)为42.2%(19/45)(图3)。在启动子高甲基化的膀胱癌中，92.3%(12/13)BLU mRNA表达异常下调和缺失。膀胱癌组织BLU mRNA表达与临床病理特征关系见表3。

图3 膀胱癌组织, 癌周正常组织和非肿瘤患者正常膀胱组织中BLU mRNA的表达（略）

Fig.3 mRNA expression of BLU in bladder tumor tissues, paired normal tissues and normal bladder tissues assayed by RTPCR