【关键词】 卵巢癌 甲基化 抑癌基因p16

【摘要】 目的 探讨抑癌基因p16基因5’端CpG岛甲基化在卵巢癌癌变过程中的作用。方法 应用甲基化特异性PCR（MSP）分别检测17例卵巢癌样本中p16基因启动子区域（M ₁ /U ₁ ）以及启动子和第一个外显子5’端部分（M ₂ /U ₂ ）的甲基化状态。结果 在我们检测的17例卵巢癌样本中，有3例M ₁ 阳性，阳性率为17.65%（3/17），这些病例恶性度较低。无1例M ₂ 阳性。结论 抑癌基因p16基因5’端CpG岛甲基化参与卵巢癌特别是恶性度低的卵巢癌的癌变过程，它可能与其它抑癌基因协同作用。

关键词 卵巢癌 甲基化 抑癌基因p16

The study on the methylation of p16gene in the ovarian cancers

Lu Lina，Wang Hanping，He Huiyi，et al.

The First People’s Hospital of Guangzhou，Guangdong510180.

【Abstract】 Objective To explore the action of the tumor-suppressor gene p16DNA methylation at the5’end in the carcinogenesis of ovarian cancers.Methods Methylation-specific PCR（MSP）was used to detect the p16gene within promoter regions（M ₁ /U ₁ ）and within the regions from promoter and the partial exon1at5’end（M ₂ /U ₂ ）for DNA methylation in17ovarian cancer samples.Results The fragments of p16gene between M 1 /U 1 were methyˉlated in3samples（3/16）which belonged to low malignancy cancers.None of samples showed methylation between M ₂ /U ₂.Conclusion The methylation of the tumor-suppressor gene p16may be important for the development of oˉvarian cancers，especially lowmalignancy cancers.It would be involved in the carcinogenesis of ovarian cancers togethˉer with the othertumor-suppressor genes.

Key words ovarian cancer methylation tumor-suppressor gene p16

卵巢癌与其它恶性肿瘤一样是一种多基因病，在卵巢癌的发生发展过程中，多个基因的分子变异起着至关重要的作用。p16是细胞周期的负调节基因，研究表明p16的基因变异如突变、纯合性丢失或5′端CpG岛甲基化等致使p16基因灭活，表达下调或缺乏，在恶性肿瘤的癌变过程中起到重要作用。大多数卵巢癌p16基因表达亦下调，但p16基因突变或纯合性丢失却较少发生;对卵巢癌p16基因甲基化的研究，则报道不一。对此，我们进行了探索，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 样本来源 随机抽取2000年1月～2001年6月我院卵巢癌手术病人17例，切除肿瘤病理结果分别为:浆液性囊腺癌6例;交界性浆液性囊腺瘤1例;内膜样癌4例;未成熟畸胎瘤4例;颗粒细胞瘤2例。

1.2 甲基化特异性PCR 应用甲基化特异性PCR（methylaˉtion-spectific PCR，MSP）分析p16基因5’端CpG岛甲基化状态，具体步骤如下。

1.2.1 DNA提取 应用试剂盒QIAamp DNA Mini Kit（购自基因有限公司）提取卵巢癌组织DNA，操作按说明书。

1.2.2 引物的设计与合成 本文研究p16基因5’端CpG岛甲基化状态 ^［1，2］ 。我们采用不同的引物分析甲基化与非甲基化状态，M ₁ /U ₁ 分析启动子区域（150bp）甲基化与非甲基化，M ₂ /U ₂ 分析启动子和第1外显子5’端部分区域（234bp）甲基化与非甲基化。所有引物均由大连宝生物工程有限公司合成。

1.2.3 DNA亚硫酸氢盐处理 将卵巢癌组织DNA溶液20 μl置95℃加热变性20min，加入新鲜配制的3M NaOH溶液5μl，置45℃20min;然后分别加入新鲜配制的0.1M氢醌12μl，3.6M亚硫酸氢钠208μl，混匀后加1滴矿物油覆盖，置55℃避光温育16h。用Wizard DNA purfication resin（购自Promega公司）纯化处理过的DNA溶液，洗脱时用50μl的双蒸水。最后在洗脱液中加入3MNaOH5μl，置40℃15min;接着用无水乙醇沉淀DNA，双蒸水溶解备用 ^［2］ 。

1.2.4 PCR反应和产物检测 每例样本均分别用甲基化引物（M ₁ 和M ₂ ）和非甲基化引物（U ₁ 和U ₂ ）加以扩增，反应体积为50μl，PCR前处理为95℃热变性5min（热启动），循环条件为94℃变性45s，60～65℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察结果。

2 结果

我们应用MSP检测了17例卵巢癌样本p16基因5’CpG岛甲基化状态，检测的区域分为两个部分，M ₁ /U ₁ 分析的是启动子区域140bp范围内甲基化状态，M ₂ /U ₂ 分析的是启动子和第1外显子5’端部分区域共224bp范围内甲基化状态。17例样本中有3例M ₁ 阳性，阳性率为17.65%;这3例样本中，1例为交界性浆液性囊腺癌，2例为颗粒细胞瘤，均属于恶性度较低的卵巢肿瘤。17例样本无1例M ₂ 阳性。

3 讨论

p16基因是一种重要的肿瘤抑制基因，它通过抑制细胞周期依赖性激酶4（CDK4）的活性而发挥负调节作用。CDK4是细胞周期的正性调节因子，它与细胞周期素D ₁ 结合形成cyclin D ₁ -CDK4复合物，该复合物使RB蛋白磷酸化，从而解除了对DNA合成的抑制，使细胞从G1期进入S期。而p16蛋白与cyclin D ₁ 竞争性结合CDK4，通过抑制其活性阻止RB蛋白磷酸化，使细胞分裂的进程在起始期受阻。p16基因若发生变异，p16不能正常表达，CDK4失去抑制而过度活化，刺激细胞异常增殖而促使肿瘤发生。不少研究已经在膀胱癌、鼻咽癌等众多恶性肿瘤及肿瘤细胞株中发现高频率的p16基因变异 ^［3］ 。在原发性卵巢癌中，p16基因突变的频率较低，且局限于粘液性卵巢癌、子宫内膜样癌等几种类型的卵巢癌;纯合性丢失的频率则更低，不管在什么类型的卵巢癌都极少发生 ^［4］ 。推测在卵巢癌中可能存在别的形式的基因变异使p16灭活。

5’CpG岛的甲基化通过阻遏转录使p16灭活，研究已经证明这种形式的p16基因变异在许多肿瘤的癌变过程中起到重要的作用。在我们研究的17例卵巢癌样本中，p16基因甲基化的检出率为17.65%（3/17），这3例样本中，2例为颗粒细胞瘤，1例为交界性浆液性囊腺瘤，均恶性度较低，这与McCluskey等 ^［4］ 的报道相吻合。推测这是由于在恶性度较低的卵巢癌中，p16基因的突变、纯合性丢失等基因变异较少出现，与此相比较，通过甲基化灭活p16基因，显得更为重要 ^［5］ 。

在本文研究的恶性度高的卵巢癌样本中，并未发现p16基因甲基化，这与本文研究p16基因的范围有关。p16基因有3个外显子，本研究仅限于启动子区域和第1外显子5’端部分;本文检出的p16基因甲基化的3例样本为启动子区域内甲基化（M ₁ 阳性），第1外显子并未检出甲基化（无M ₂ 阳性），这与文献报道相一致 ^［6］ 。Niederacher等 ^［7］ 亦 未检出第1外显子的甲基化，但却检出较高频率的第2外显子甲基化，且仅限于恶性度高的卵巢癌。第2外显子甲基化的作用机制尚不清楚，推测在恶性度高的卵巢癌癌变过程中，可能存在其它抑癌基因的灭活，例如与p16基因共享第2外显子的p15或p19基因。

本文由于研究例数较少，不能进行归类分析，因此无法得知卵巢癌特异性基因变异模式。我们初步研究的结果提示，抑癌基因p16甲基化参与卵巢癌特别是恶性度低的卵巢癌癌变过程，它可能与其它抑癌基因一起协同参与。

参考文献

1 Herman J G，Graff JR，Myohanen S，et al.Methylation-specific PCR:A novel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:9821-9826.

2 McCluskey LL，Chen C，Delgadillo E，et al.Differences in p16gene methylation and expression in benign and malignant ovarian tumors.Gyˉnecol Oncol，1999，72:87-92.

3 Carius P，Mao L，Merlo A，et al.Rates of p16mutations in primary tuˉmors with9p loss.Science，1994，265:415-416.

4 Milde-Langosch K，Ocon E，Becker G，et al.p16/MTS1inactivation in ovarian carcinomas:high frequency of reduced protein expression associˉated with hyper-methylation of mutation in endometrioid and mucinous tumors.Int J Cancer，1998，79:61-65.

5 McCluskey LL，Dubeau L.Biology of ovarian cancer Curr Opin Oncol，1997，9:465-670.

6 Ryan A，Al-Jehani RM，Mulligam KT，et al.No evidence exists for methylation inactivation of the p16tum