【关键词】 卵巢癌细胞

【摘要】 目的 以人卵巢癌细胞系HO-8910为对象，以人黑色素瘤细胞株A-375为阳性对照，以细胞抑制率、细胞凋亡为指标，评价8种化疗药物在体外诱导卵巢癌细胞凋亡效应，为临床卵巢癌患者个体性化疗提供实验依据。 方法 （1）应用MTT法检测8种化疗药物对卵巢癌细胞系HO-8910细胞和对照组不同时间、不同浓度化疗药物及其组合的细胞抑制率进行对比，筛选出抑制率最高的化疗药物并进行组合;（2）通过FCM法检测其诱导细胞凋亡的效果，采用Annexin-V-FITC结合碘化丙啶（PI）染色和TdT介导X-dUTP缺口末端标记（TUNEL）。 结果 （1）在MTT法定量检测中，8种化疗药物作用48h对HO-8910细胞系生长抑制率与对照组相比具有不同程度的差异性，其中以4PPC（32μg/ml）的CDDP与4PPC（0.12μg/ml）的As 2 O 3 效果最显著，此时HO-8910细胞系的细胞抑制率分别为80.43%和73.37%，与对照组比较，差异有显著性（P=0.01）;4PPC（216μg/ml）的紫杉醇、1/2PPC（80μg/ml）的5-FU对HO-8910细胞系的生长抑制率分别为70.45%和88.95%，与对照组比较，差异无显著性（P>0.05）;4PPC（0.544μg/ml）的奥沙利铂、2PPC（26μg/ml）的MTX、4PPC（0.12μg/ml）的VCR对HO-8910细胞系的生长抑制率分别为69.52%、71.88%和68.63%，与对照组比较，差异无显著性（P>0.05）;BLM对HO-8910细胞系生长无抑制作用;（2）FCM法定量检测CDDP+BLM+紫杉醇化疗药物组合作用2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h9个时间段对HO-8910细胞系的细胞凋亡率，与空白对照组比较具有不同程度的差异性，其中以作用48h的细胞凋亡率最高（75.70%），差异有显著性（P=0.0136）。 结论 （1）卵巢癌细胞的化疗敏感性与化疗药诱导的卵巢癌细胞凋亡密切相关;（2）细胞抑制率、早期细胞凋亡、晚期细胞凋亡、细胞凋亡率可作为制定卵巢癌个体性治疗方案的评价指数体系;（3）在细胞抑制率的基础上优选出相应的抗癌药物，再通过细胞凋亡率评价抗癌药物的优化组合方案，这一肿瘤个体性化疗方案制定程序具有可行性，为卵巢癌者个体性化疗方案的制定提供了一个有用的研究模式。

关键词 卵巢癌 细胞凋亡 体外 药敏实验 MTT法 FCM法

Chemosensitivity of ovarian cancer cell lines apoptosis in vitro

Liu Yi

Department of Obstetrics and Gynecology，Zunyi Medical College，Zunyi563000.

【Abstract】 Objective To study the characteristics of the ovarian cancer cell lines HO-8910apoptosis which is induced by chemotherapy drugs and the relationship between the ovarian cancer chemosensitivity.Methods （1）By using MTT test methods gets the growth inhibition precence of ovarian cancer cell lines HO-8910，so we can pri-marily choose the best chemotherapy drugs and their corporations.They can be used as the foundation of the FCMtest methods.（2）Through the FCM test methods of binding the Annexin-V-FITC with PI and TUNEL kit，can test the ovarian cancer cells'earlier apoptosis percence and later ones of the different time and different dose of chemotherapy drugs and their corporations.Then can analyze and make the ovarian cancer cell lines HO-8910's apoptosis chart，so get the chemosensitivity lines to the cell lines uniquely.Results （1）In the MTT test methods，the ovarian cancer cell lines HO-8910has all levels different responses to the8chemotherapy drugs verus human blake tumor cell lines.（2）In the FCM test methods，the corporation of CDDP+Taxol+BLM has the best apoptosis，contrasting to the blank control has conspicous difference（P<0.05）.Conclusion （1）The ovarian cancer chemosensitivity has closely correlation with the apoptosis of ovarian cancer.（2）The in vitro chemosensitivity experiment of apoptosis has made reference index for preclinical test of the ovarian cancer in vitro chemosensitivity experiment.

Key words ovarian carcinoma apoptosis in vitro chemosensitivity experiment MTT test methods flow cytometric test methods

卵巢癌具有恶性度高、易复发、易产生多药耐药的特性，患者5年生存率一直徘徊在20%～30%之间 ［1］ 。近年来，随着细胞凋亡研究的深入，发现细胞凋亡阻抑是卵巢癌产生多药耐药现象的直接原因 ［2］ 。

1 材料与方法

1.1 肿瘤细胞系 HO-8910细胞系购于中国科学院上海细胞库，人黑色素瘤细胞株A-375由遵医附院皮肤科教研室赠送。

1.2 药品、试剂及配制方法

1.2.1 所需药品、试剂 胎牛血清、RPMI1640培养基购于GIBICO公司，MTT试剂、DMSO购于SIGMA公司，Annexin-V-FITC流式细胞试剂盒（BD BIOSCIENCE Pharmingen，型号556547/6693KK）、TUNEL法的流式细胞试剂盒APO-DI-RETM KIT（ALEXIS BIOCHEMCALS，型号850-041-K101）均购于深圳晶美试剂公司，化疗药物BLM、奥沙利铂、CD-DP、紫杉醇、5-FU、MTX、VCR、As 2 O 3 均购于遵医附院药剂科，胰蛋白酶1∶250购于北京华美试剂公司。

1.2.2 细胞合成培养液的配制与灭菌 见《细胞培养的基本原理及技术》。

1.2.3 0.25%胰蛋白酶溶液的配制与灭菌 见《细胞培养的基本原理及技术》。

1.2.4 化疗药物的配制 配制BLM、奥沙利铂、CDDP、紫杉醇、5-FU、MTX、VCR、As 2 O 3 8种化疗药物的工作浓度，参照体外药敏实验相关文献中化疗药物工作浓度的选择，以PPC作为药物工作浓度的基础，用生理盐水配制成50PPC的母液，置于-20℃冰箱中保存 ［1］ 。（1）计算8种药物的PPC［PPC（μg/ml）=50×D（mg/kg）/5000×2×103］ ［2］ 。①BLM:PPC=0.192μg/ml;②奥沙利铂:PPC=0.136μg/ml;③CDDP:PPC=8μg/ml;④紫杉醇PPC=54μg/ml;⑤5-FU:PPC=160μg/ml;⑥MTX:PPC=13μg/ml;⑦VCR:PPC=0.03μg/ml;⑧As 2 O 3 :PPC=0.3μg/ml。（2）配制8种化疗药物的工作浓度:从冰箱中解冻配制的母液，用合成培养液将其稀释琢1/4、1/2、1、4、10、20倍PPC。

1.3 主要仪器 CO 2 培养箱（国产），TCAN酶标荧光仪，流式细胞仪（FACSCalibur台式机）。

1.4 实验分组

1.4.1 MTT法的分组 处于指数生长期的HO-8910细胞、人黑色素瘤细胞未用药组为对照组;处于指数生长期的HO-8910细胞、人黑色素瘤细胞用药组为实验组。

1.4.2 FCM法的分组 处于指数生长期的HO-8910细胞未用药组为对照组;处于指数生长期的HO-8910细胞用药组为实验组。

1.5 实验步骤

1.5.1 HO-8910细胞系传代培养和生长周期的观测 （1）收集细胞:将进入指数生长期的细胞用酶消化法收集到另一无菌培养瓶中;（2）将收集到的细胞悬液，细胞同步化生长;（3）每隔24h，取出24孔细胞培养板在超净台上，用酶消化法收集3孔内细胞，分别计数每孔内细胞密度（每孔计数3次，取其平均值），再计数3孔细胞密度，取其平均值，得到细胞生长曲线上第1个标记点。依次得到细胞生长曲线上11个标记点，绘制出HO-8910细胞在本实验室条件下的细胞生长曲线。

1.5.2 抗癌药对HO-8910细胞的抑制效应实验 见MTT法。

1.5.3 抗癌药诱导HO-8910细胞凋亡实验 见FCM法。

1.6 评价指标及方法

1.6.1 细胞抑制率 （1）本课题采用MTT法作为细胞抑制率检测方法。（2）MTT法步骤:①弃去实验组含药物的培养液与对照组不含药物的培养液，每孔加入100μl D-Hank's液洗2次;②加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）培养液150μl放入CO 2 养箱内孵育24h，再加入MTT（5mg/ml）作用4h;③吸尽培养板中的上清液，每孔加入DMSO200μl，振荡10min，在自动免疫荧光仪上设定550nm和630nm的波长，分别测每孔吸光度值A1值和A2值，A1减A2即为每孔的A值，取其3孔求平均值，重复3次取平均值。（3）细 胞抑制率的计算及评价:细胞抑制率=（1-实验组平均光密度A值/对照组平均光密度A值）×100% ［3］ ，重复3次取其平均值，筛选出敏感的化疗药物。细胞生长抑制率:>70%为敏感;50%～70%为中度敏感;<50%为耐药 ［4］ 。

1.6.2 早期细胞凋亡 （1）FCM法结合FITC标记的An-nexin-V联合PI染色作为卵巢癌体外药敏实验的早期细胞凋亡检测方法。原理:根据Ca 2+ 依赖的磷脂结合蛋白Annexin-V能高亲和结合PS的原理 ［5］ ，Annexin-V作为检测细胞表面PS的敏感探针，用于细胞凋亡早期的检测。由于坏死细胞的细胞膜丧失其完整性，亦可能出现PS外翻，故同时使用膜非通透性DNA染料PI则能从Annexin-V染色的细胞中将凋亡和坏死细胞区别开来，即:Annexin-V（+）/PI（-）为凋亡细胞;Annexin-V（+）/PI（+）为坏死细胞。（2）Annexin-V-FITC+PI染色步骤及FCM检测:①用冷FBS液（pH7.4）洗细胞2次，然后用1×buffer重新悬浮细胞悬液使细胞密度为1×106个/ml;②吸取100μl上步骤制备的单细胞悬液至5ml流式孵育管内，每管加入Annexin-V-FITC5μl与PI染液5μl，轻轻振荡细胞后在室温避光孵育15mi