【关键词】 大肠肿瘤 VEGFD VEGFR3 淋巴管密度 转移

Relationship between expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF)D and VEGF receptor (VEGFR)3 and lymphangiogenesis in carcinoma of large intestine

ZHANG ZhiYong, JIANG Li, GAO YanMin, et al

Department of Pathology, Tangshan Workers Hospital Affiliated to Hebei Medical University, Tangshan 063000, Hebei, China

【Abstract】 Objective To explore the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)D and VEGF receptor (VEGFR)3, feature of D240 positive lymphatic and lymphangiogenesis to analyze their relation to clinical biological behaviour and prognosis.Methods The expression of VEGFD and VEGFR3 and lymphatic vessel density (LVD) in 148 cases of carcinoma of large intestine were detected by immunohistochemistry.Results The positive rate of VEGFD and VEGFR3 (79%, 52%) in lymph node metastasis group were higher than those (61%, 34%) of non lymph node metastasis group, those of relapse metastasis group (82%, 52%) were higher than those of non relapse metastasis group (59%, 34%), those of survival time ≤3 years group (81%, 62%) were higher than those of survival time ＞3 years group (59%, 35%) (all P＜0.05). The positive rate of VEGFD in lymphatic involvement group（85%）was higher than that in non lymphatic involvement group（60%）（P＜0.05）. LVD value in ulceration and invasion group was higher than that in bump group, that in Dukes’ C and D staging was higher than that of Dukes’ A and B, that in lymph node metastasis group was higher than that in non lymph node metastasis group, that in lymphatic involvement group was higher than that of non lymphatic involvement group, that in relapse metastasis group was higher than that in non relapse metastasis group, that in survival time ≤3 years group was higher than that of survival time ＞3 years group (all P＜0.05）.Conclusions The increased expression of VEGFD and VEGFR3 should be related to lymphangiogenesis, lymph node metastasis, relapse metastasis and poor prognosis.

【Key words】 Carcinoma of large intestine；Vascular endothelial growth factor (VEGF)D；Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)3；Lymphatic vessel density (LVD); Metastasis

淋巴转移是大肠癌转移的主要途径，血管内皮生长因子D (VEGFD)与其受体VEGFR3 相互结合后促进肿瘤淋巴管生成和(或)扩张，与淋巴转移密切相关 〔1〕，D240是目前淋巴管内皮细胞最为特异的标记蛋白〔2〕，三者在大肠癌中的研究国内尚无报道。本研究检测大肠癌中VEGFD、VEGFR3表达以及D240阳性淋巴管密度 (LVD)，探讨其与大肠癌临床生物学行为、复发转移及预后的关系。

1 材料与方法

11 材料 收集 2000～2002 年手术切除的148例大肠癌及51例正常大肠黏膜存档蜡块，所有标本均经术后病理证实，正常大肠黏膜组织来自同一大肠癌切缘组织。患者均术前未行任何治疗，术后正规治疗。其中男80例，女68例。年龄27～83 岁,平均 592岁，＞60岁组64例，≤60岁组84例。右半结肠48例，左半结肠100例。肿瘤直径1～13 cm，均数43 cm≤5 cm组105例，＞5 cm组43例。溃疡型和浸润型生长124例，肿块型生长24例。非黏液性腺癌122例，黏液性腺癌26例。高分化22例，中分化 103 例，低分化 23例。DukesA期31例、B期49例、C期60例、D期8例。无淋巴结转移组85 例，淋巴结转移组63例。无淋巴管受累组96例，淋巴管受累组52例。随访时间36～58月，≤3年组68例，＞3年组80例。复发及远处转移 (包括肝、肺远处转移等)情况：无复发转移组83例，复发转移组65例。

12 方法

121 试剂 一抗：鼠抗人 VEGFD 多克隆抗体购自美国 R&D公司；兔抗人 VEGFR3 多克隆抗体购自美国Lab Vision 公司；鼠抗人 D240 单克隆抗体购自中杉金桥生物技术公司；一抗稀释浓度VEGFD 1:100；VEGFR3 1:100。二抗EnVision试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

122 方法 选取大肠癌及正常黏膜存档蜡块，连续4 μm切片。采用免疫组化EnVision法依试剂盒提供步骤操作。用已知阳性的大肠癌为阳性对照，PBS 代替一抗为阴性对照。

13 结果判定

131 VEGFD、VEGFR3结果判定 VEGFD阳性表达位于上皮细胞胞浆内，VEGFR3阳性表达主要位于间质细胞或癌细胞胞浆内。为浅黄色至棕褐色颗粒。不着色～弱着色为阴性表达，中等着色～强着色为阳性表达。

132 淋巴管计数方法 D240染色阳性标记的脉管数视为LVD，参照 Weidner〔3〕方法进行计数。

14 统计学处理 运用 SPSS 130 统计软件进行χ2检验、t检验。

2 结果

21 VEGFD、VEGFR3的表达 正常大肠黏膜存在少量VEGFD表达，主要位于上皮细胞胞浆。VEGFR3在上皮细胞无表达，间质中可见到少量阳性细胞。大肠癌中VEGFD表达主要位于肿瘤细胞的胞浆，肿瘤间质无明显表达。VEGFR3在间质细胞及脉管表达，而且少量在肿瘤细胞胞浆内可见表达（见图1～图2）。大肠癌VEGFD和 VEGFR3阳性率分别为69%、42%，正常大肠黏膜阳性率分别为14% 、8% (均P＜001)。

图1 VEGFD在大肠癌中的阳性表达(EnVision ×200)（略）

图2 VEGF R3在大肠癌中的阳性表达(EnVision ×200)（略）

图3 大肠癌中D240阳性标记的淋巴管,箭头指淋巴管瘤栓(EnVision×100)（略）

22 VEGFD、VEGFR3表达与大肠癌临床生物学行为及预后的关系 VEGFD 、VEGFR3 在淋巴结转移组阳性率（79%、52%）高于无淋巴结转移组（61%、34%）、复发转移组阳性率（82%、52%）高于无复发转移组（59%、34%）、生存期≤3年组阳性率（81%、62%）高于生存期＞3年组（59%、35%）（均P＜005）、VEGFD在淋巴管受累组阳性率（85%）高于无淋巴管受累组（60%）（P＜005），二者表达均与年龄、性别、肿瘤部位、大小、大体形态、组织学类型、分化程度、Dukes分期无关（P＞005）。

23 微淋巴管免疫组化形态观察 D240较特异性地表达在淋巴管内皮细胞，血管内皮细胞和肿瘤细胞未见表达。正常黏膜的淋巴管很少且散在分布，大肠癌癌巢之间及外周均可见淋巴管，癌巢之间管腔小，多为闭锁状态，癌周管腔较大，更多为扩张。癌栓多见于癌周扩张的淋巴管（见图3）。大肠癌中LVD为1566 ±482，正常黏膜中LVD为500±195（P＜001）。

24 LVD与大肠癌临床生物学行为及预后的关系 LVD在溃疡型和浸润型组1692±507中高于肿块型组1505±194，Dukes C、D期1663±546高于Dukes A、B期1483±405，淋巴结转移组1687±512高于无淋巴结转移组1475±440，淋巴管受累组1725±534高于无淋巴管受累组1479±430，复发转移组1676±483高于无复发转移组1437±461，生存期≤3年组1787±799高于生存期＞3年组1386±388（均P＜005），LVD值与年龄、性别、肿瘤部位、大小、组织学类型、分化程度无关（P＞005）。

3 讨论

近年来大肠癌发病率和5年生存率有升高的趋势，严重危害人类健康。淋巴结转移是影响预后的重要因素之一。新近研究表明许多肿瘤存在新生淋巴管机制，肿瘤淋巴管生成正在成为研究肿瘤转移新的靶点。目前淋巴管生成因子与淋巴管生成、肿瘤生物学行为的关系及机制尚未完全阐明。

血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞特异的有丝分裂原， VEGFD为淋巴管生长因子，可作用于淋巴管内皮细胞上VEGFR3并使之激活，促进淋巴管内皮细胞的增殖和淋巴管的生成 〔4〕。大肠癌与淋巴管侵犯、淋巴结转移和浸润深度及预后有关〔5〕。VEGFD高表达与大肠癌复发、生存时间明显缩短、淋巴结转移相关，是独立的预后因素〔6〕。本研究中VEGFD、VEGFR3在大肠癌中表达较在正常黏膜中明显增多，提示VEGFD、VEGFR3表达升高在肿瘤的发生发展中起作用。VEGFD、VEGFR3在淋巴结转移组中均显著高于无淋巴结转移组，在有复发转移组的阳性表达明显高于无复发转移组，在3年生存期明显缩短组表达高于3年生存期较长组，在淋巴管受累组较无淋巴管受累组中VEGFD表达增高，这些结果均表明VEGFD、VEGFR3表达升高与大肠癌淋巴道转移有关，为大肠癌预后不良的一项辅助判断指标。

VEGFD表达增高导致淋巴管密度的增加与淋巴结转移密切相关，是促进大肠癌发生淋巴结转移的重要原因〔7〕。D240最初是从胎儿的睾丸和生殖细胞肿瘤中分离出的M2A抗原，能与淋巴管内皮反<