【摘要】 目的 探讨大肠癌组织Fas抗原及p53蛋白的表达及临床意义。方法 采用免疫组织化学方法对32例大肠癌组织的Fas抗原，16例正常大肠组织及p53蛋白表达进行检测和比较。结果 Fas抗原在正常大肠组织中表达阳性，p53蛋白在正常大肠组织中表达阴性，Fas抗原在大肠癌组织中表达阳性率为40.62%（13/32），p53蛋白在大肠癌组织中的表达阳性率为53.13%。Fas抗原及p53蛋白在大肠癌组织中的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位、大体分型、浸润深度、Ducks及局部淋巴结转移等无明显关系（ P＞0.05），Fas抗原在大肠癌组织明显下降，Fas抗原表达与大肠癌组织学类型及肝转移相关（ P＜0.05）。p53蛋白表达与大肠癌肝转移相关（ P＜0.05）。结论 Fas抗原在大肠癌组织中表达明显下降。随着肿瘤恶性程度的提高，Fas抗原表达减少。在肝转移患者中未见表达。p53蛋白在大肠癌组织中表达阳性，尤以发生肝转移者为著。Fas抗原表达下降或缺乏及p53蛋白过度表达均提示预后不良。

【关键词】 结直肠肿瘤

Fas抗原在许多正常和恶性肿瘤组织中广泛表达，其在组织中的表达变异或功能异常与肿瘤的发生及发展密切相关[1，2]。肿瘤抑制基因p53对细胞的生长调控起重要作用，它在多数肿瘤中失活，在大肠癌中表现为p53蛋白的异常表达，但p53蛋白是否与临床生物学意义有关，尚无定论。我们采用免疫组织化学方法检测大肠癌组织中Fas抗原及p53蛋白的表达情况及其临床生物学意义。探讨他们之间的关系。

 资料与方法

1.1 一般资料

32例大肠癌组织均来自西京医院1995—1998年胃肠外科手术切除标本，并经手术及病理证实。男性19例，女性13例，年龄28~87岁，平均53.69岁。术前均未接受放疗及化疗。病变部位：结肠7例，直肠25例，大体分型：隆起型11例，溃疡型18例，浸润型3例。镜下组织学分型：腺癌25例，粘液癌6例，未分化癌1例。病理分级：Ⅰ级15例，Ⅱ级12例，Ⅲ级5例。Ducks’分期：A期14例，B期10例，C期3例，D期5例。局部淋巴结转移6例，肝转移5例。根治性切除26例，姑息性切除6例。术中腹腔5氟脲嘧啶或氟脲脱氧核苷冲洗。切除组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，切片厚4 μm。

1.2 试剂及染色方法

兔抗人Fas多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，小鼠抗人p53蛋白单克隆抗体为美国SIGMA公司产品（BP 5212）。SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。免疫组织化学染色方法：石蜡切片脱蜡至水；0.3%H2O2甲醇阻断内源性过氧化酶活性，室温下30 min；5%正常山羊血清封闭非特异性背景染色，室温下30 min；切片加兔抗人Fas多克隆抗体及小鼠抗人p53蛋白单克隆抗体（1:50），置湿盒内4℃冰箱过夜；切片加生物素化学羊抗兔及羊抗小鼠 IgG（1:100），37℃，30 min，切片加SABC复习物（1:100），37℃，30 min DAB显色，而定终止反应；自来水冲洗，苏木精复染细胞核；切片常规脱水，透明，封固，镜下观察结果。

1.3 结果判定

光镜下观察Fas抗原及p53蛋白免疫组织化学染色。数10个高倍视野1 000个细胞，计数阳性细胞数。Fas抗原阳性反应主要为棕黄色均匀系细颗粒位于细胞浆内和（或）细胞膜上。p53蛋白阳性反应为棕黄色均匀细颗粒，位于细胞核内。阳性细胞数≥10%为阳性。＜10%为阴性。

1.4 统计学处理

Fas抗原及p53蛋白表达与临床生物学指标间的关系用χ2检验。Fas抗原与p53蛋白表达之间的关系用配对χ2检验。

 结果

2.1 Fas抗原及p53蛋白测定结果

32例大肠癌组织中Fas抗原阳性13例，阴性19例，阳性率40.62%。16例正常大肠组织Fas抗原表达均为阳性。32例大肠癌中p53蛋白阳性17例，阴性15例，阳性率为53.13%，16例正常大肠中p53蛋白均为阴性。大肠癌Fas抗原及p53蛋白表达阳性率与正常组织有非常显著差别（ P＜0.05）。见表1。表1 大肠癌与正常大肠组织Fas抗原及p53蛋白表达（略）

32例大肠癌组织中，Fas抗原及p53蛋白均表达异常者14例，Fas抗原正常而p53蛋白异常者3例，Fas抗原异常而p53蛋白正常者5例，均正常者10例，见表2。表2 Fas抗原及p53蛋白表达的关系（略）

经配对卡方分析χ2=0.5000，（ P=0.4795。Fas抗原表达与p53蛋白表达相关，即Fas抗原表达与p53表达相吻合。

2.2 Fas抗原及p53蛋白表达检测结果与患者年龄、性别、肿瘤部位、距肛门缘距离、大体分型、组织学分类、浸润深度、Ducks分期、肿瘤大小、浸袭范围、淋巴结转移、肝转移等指标的关系从表3可见Fas抗原及p53蛋白表达与大肠癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、距肛门缘距离、大体分型、浸润深度、Ducks分期、肿瘤大小、侵袭范围、局部淋巴结转移等无明显相关（P＞0.05）。Fas抗原表达与大肠癌组织学分类及肝转移相关。大肠癌伴肝转移者p53蛋白阳性率显著高于无肝转移者（P＜0.05）。

 讨论

大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。其发病率及死亡率呈上升趋势。大肠癌的浸润与转移受细胞内多个基因的调控。采用生物学技术寻找肿瘤浸润与转移的新指标是当今肿瘤学研究热点之一。1989年，Yonehara，Trauth分别分离到两种对人类多种细胞系具有溶解作用的鼠源性抗体，将这种抗体识别的细胞表面蛋白质分别命名为Fas，APO1。进一步研究证明两者为同一物质，并命名为CD95。Fas抗原是由319个氨基酸组成的相对分子量为3 6000的型跨膜糖蛋白，属神经生长因子和（或）肿瘤坏死因子受体超家族成员，是一个细胞凋亡信号受体，它与Fas抗体或Fas配体（FasL）结合后，其胞浆区经特殊细胞内蛋白介导，直接激活凋亡基因产物，可以诱导Fas抗原所在的细胞凋亡。细胞膜表达有功能的Fas抗原，并且其表达量达到一定强度时是Fas系统诱导凋亡的先决条件。细胞凋亡是由基因调控的细胞主动死亡过程，是程序性细胞死亡的主要形式。此过程的异常与肿瘤发生有密切关系。某些细胞在其发生，发展过程中Fas抗原量不断增加，而凋亡抑制基因bcl2的表达逐渐减少，最终导致细胞凋亡的发生完成细胞代谢过程，达到细胞增殖与凋亡的平衡。由Fas抗原，Fas抗体或配体及其细胞内信号传导分子共同构成的Fas系统在诱导细胞凋亡中的独特作用，使其成为恶性肿瘤免疫及生物治疗的热点。机体中许多组织和细胞都可表达或经激活诱导表达Fas抗原，以免疫系统表达最丰富。正常情况下，人表皮基底细胞、皮脂腺，肾上腺、小肠、大肠上皮细胞，肝脏等均可表达Fas抗原，在免疫系统中部分胸腺细胞，外周记忆的淋巴细胞，单核细胞，淋巴窦中的细胞均有Fas抗原表达。某些肿瘤细胞也能表达Fas抗原，但其表达的水平较淋巴母细胞低。干扰素作用于淋巴细胞可上调Fas抗原的表达。大多数良性肿瘤如结肠腺瘤。纤维瘤等，表达类似于其来源的正常组织，而恶性肿瘤的Fas表达明显下调或丢失，发生转移的肿瘤则几乎完全丢失。正常结肠上皮持续高表达Fas抗原，其功能尚未证明，从正常结肠上皮到结肠良性新生物，恶性肿瘤，Fas抗原持续减少，丧失的程度与疾病的程度有关，腺瘤缺失10%，而癌缺失88%，尤以发生转移为著[3]。Butler[3]，Reyher[4]等对Fas抗原在大肠癌中的表达进行了研究，他们对比了正常结肠组织与结肠癌细胞的Fas表达情况，结果发现结肠癌细胞Fas抗原表达明显下调或缺失。本实验发现Fas抗原在正常大肠组织中均有表达，阳性率为100%，Fas抗原在大肠癌细胞中表达下降，阳性率仅为40.62%， 与正常大肠组织相差非 常 显 著 （ P＜0.01）。这一结果提示肿瘤在发生过程中可能有某些机制使Fas系统表达异常或功能丧失及异常，导致信号的破坏或无活性，不能进行正常的凋亡活动，使异常细胞得以逃避机体的免疫监视作用，导致异常细胞的存活与发展，从而促进恶性肿瘤的发生与发展。最近研究表明，肿瘤不仅仅是通过低表达被动的逃避机体免疫监控，而是主动杀伤与之接触的活性免疫细胞。本实验结果显示Fas抗原的表达与患者的性别，年龄，肿瘤部位，大小，距肛门缘距离，大体分型，侵袭范围，浸润深度，分期及淋巴结转移无明显关系（P＞0.05）。与肿瘤的组织学类型及肝转移呈负相关（P＜0.05）。Muller[5]对结肠上皮细胞表达研究结果为结肠上皮正常表达Fas抗原，少部分腺瘤及大部分结肠癌Fas抗原持续减少或缺失，尤在发生转移时为著。结果亦为Fas抗原的丢失程度与疾病的程度有关，尤以发生转移为著。

本实验结果显示随着组织分离恶性程度的提高，Fas抗原阳性率下降，两者呈负相关（P＜0.05），即随着肿瘤恶性程度的提高，Fas抗原的表达越易缺失。随着Ducks分期的增加，Fas抗原阳性率有下降趋势，但无统计学意义（P＞0.05），可能与样本数偏小有关，有待于进一步积累病例，增加样本量加以深入研究，探讨两者间是否有关联。Fas抗原的表达在大肠癌肝转移中可能起重要作用，大肠癌肝转移是大肠癌晚期的表现，是判定大肠癌预后的重要指标，本实验结果示大肠癌肝转移者Fas抗原表达更易缺失，Fas抗原表达异常对预测大肠癌患者预后有重要价值。Fas抗原是大肠癌上皮凋亡所必需的，Fas抗原的丧失可能与大肠癌凋亡能力下降有关。本实验结果显示大肠癌Fas抗原明显下调，发生转移的肿瘤几乎完全消失，提示恶性肿瘤通过Fas抗原丢失逃避体内免疫系统对其清除作用。p53基因的发现经历了肿瘤抗原，原癌基因和抑癌基因三个阶段。直至发现p53有野生型和突变型之分才确认它是一种肿瘤抑制基因[6]。p53基因的突变和丢失是多种肿瘤发生的原因之一，当其发生改变时，其产物p53蛋白可出现异常，导致抑癌功能丧失。野生型p53蛋白的生理功能主要是参与细胞内DNA的修复及诱导细胞凋亡。正常