【摘要】 目的 探讨大肠癌组织中胸腺素β4基因的表达及其临床意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR) 方法，检测41例大肠癌患者肿瘤组织及正常黏膜组织中胸腺素β4基因mRNA的表达。结果 半定量RTPCR显示所有癌组织中均有胸腺素β4 mRNA表达，但在部分正常黏膜组织中表达缺失。癌组织平均表达量为0.65±0.21，正常黏膜组织为0.42±0.19 (P＜0.01)。其表达与淋巴结转移和临床分期有关，在有淋巴结转移组中胸腺素β4 mRNA表达(0.82±0.23)明显高于无淋巴结转移组(0.53±0.19)(P＜0.05)；C+D期组中胸腺素β4 mRNA表达(0.82±0.22)明显高于A+B期组(0.51±0.18) (P＜0.05)，与肿瘤大小、分化程度、患者性别、年龄、肿瘤部位无关。结论 大肠癌组织中胸腺素β4的表达与肿瘤的转移播散相关，胸腺素β4可作为判断大肠癌转移播散和临床分期的参考指标。

【关键词】 大肠癌; 胸腺素β4;逆转录-聚合酶链反应

Expression of Thymosin β4 Gene in Human Colorectal Cancer Tissues and its Clinical Significance

ZHOU Rui, YUAN Hongyin, XIONG Bin，MAO Ming

Department of Oncology, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan 430071, ChinaAbstract：Objective To study the expression of thymosin β4 in colorectal cancer and its clinical significance.Methods Fortyone cases of human colorectal cancer specimens was collected from the patients who received operation for colorectal cancer from 12/2003 to 11/2004. All of the specimens were determined for mRNA expression of thymosin β4 by using RT PCR technique. Results Thymosin β4 mRNA was highexpressed in colorectal cancer specimens although they were also expressed in normal colorectal specimen. The results of semiquantitative PTPCR analysis showed the expression of thymosin β4 mRNA was 0.65±0.21 and 0.42±0.19 in cancer and normal tissues, respectively, P＜0.01. The relative values of mRNA in lesions with metastatic lymph nodes (0.82±0.23) was higher than those of nonmetastatic lymph nodes (0.53±0.19)(P＜0.05); expression of thymosin β4 in Duke C or Duke D stage(0.82±0.22) was significantly higher than that in Duke A or Duke B stage (0.51±0.18). There was a close relation between thymosin β4 mRNA expression and several clinicopathological factors including lymph node metastasis, and TNM stage.Conclusion Thymosin β4 gene expression in colorectal cancer may serve as a parameter for judging tumor biological characteristic and clinical significance.

Key words： Colorectal carcinoma; Thymosin β4; RTPCR

胸腺素β4是一种多功能的小分子多肽， 它在免疫、 细胞运动、 血管生成、 凋亡、 创伤愈合和炎症等方面发挥重要作用。 近年来， 胸腺素β4与肿瘤的关系引起研究者的关注， 发现胸腺素β4在乳腺癌、 结直肠癌等肿瘤中表达增高[1,2]。 并且发现胸腺素β4在已转移的瘤细胞中的含量较正常组织高[3]。 但是胸腺素β4在大肠癌中表达的临床意义仍不清楚， 我们采用逆转录聚合酶链反应技术(RTPCR )检测了41例大肠癌及其对应正常大肠黏膜组织中胸腺素β4 mRNA的表达, 探讨胸腺素β4表达的临床意义。

1 资料和方法

1.1 病例资料和组织标本

收集武汉大学中南医院2003年12月～2004年11月经组织病理学证实的结直肠腺癌手术新鲜组织标本41例, 同时收集肿瘤组织和对应正常大肠黏膜组织(距肿瘤边缘>15cm)。所有标本均于肿块切除后30min内置于-80℃冰箱中保存。男26例, 女15 例, 年龄36～80岁, 平均58岁。按Dukes分期：A 期10例，B期13例，C期14例， D期4例。

1.2 主要试剂

RNA酶抑制剂、dNTPs、MMulv逆转录酶、随机引物、Tag DNA聚合酶等购自MBI Fermentas公司,电泳级琼脂糖购自美国Promega公司，RNA提取试剂盒(Trizol试剂)、PCR markers等购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 引物序列及合成

软件设计(PUBMED中BLAST中查到)的胸腺素β4基因引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。胸腺素β4基因扩增片段长度为178bp,引物序列如下: 5′ACAAACCCGATATGGCTGAG3′，5′GAAGGCAATGCTTGTGGAAT3′。

为验证cDNA是否逆转录成功, 以磷酸丙糖脱氢酶(GAPDH) 为内对照。GAPDH 引物用软件设计, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 扩增片段为439 bp, 引物序列如下: 5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，5′TCCACCACCCTGTTGCTG TA3′。

1.4 组织总RNA提取

按Trizol试剂盒说明书进行操作。

1. 5 RNA含量及质量鉴定

提取出的RNA经凝胶电泳鉴定其质量, 紫外分光光度计测定RNA含量。

1. 6 逆转录合成cDNA

20μL逆转录反应体系包含总RNA 3μL，0.5μg/μL Oligo(dT)181μL，DEPC处理水加至12μL，混匀，离心5 s，70℃加热5min。立即冰浴，稍离心。加20U/μL RNA 酶抑制剂1μL，5×buffer 4μL，10mM dNTP混合物2μL，混匀稍离心，37℃ 5min。再加入200U/μL MMuLv逆转录酶1μL，置于42℃下反应1小时，70℃下10min灭活逆转录酶，最后放入-80℃冰箱中备用。

1.7 PCR扩增及电泳结果判定

50μL PCR反应体系包含cDNA 3μL，2mM dNTP混合物5μL，10×PCR buffer 5μL，正反向引物各10 pmol，1U/μL Taq酶1.25μL，25mM MgCl2 3μL，DEPC处理水补至50μL， 混匀后置于PCR扩增仪上。胸腺素β4的反应条件为95℃预变性5min，94℃变性30s， 55℃退火40s，72℃延伸30s，30个循环后再72℃延伸7min。GAPDH 的反应条件为95℃预变性5 min，94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸30s，30个循环后再72℃延伸7min。

1. 8 PCR扩增产物相对定量分析

8μL PCR产物经1.5%的普通琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙啶染色，通过凝胶扫描仪(美国Alpha Innotech公司) 进行DNA电泳条带和光量子强度分析，将胸腺素β4与GAPDH比值作为胸腺素β4表达水平的参数，对胸腺素β4 PCR 产物相对定量。

1. 9 统计学处理

胸腺素β4 mRNA相对表达量用 ±s表示，两组之间的差异采用t检验，以P＜0.05和P＜0.01表示差异的显著性。采用SPSS11.5统计软件包处理。

2 结果

2. 1 RNA质量及含量鉴定

提取出的RNA经琼脂糖变性凝胶电泳显示5s、18 s、28s 3条RNA电泳带， RNA 经紫外分光光度计测定吸光度260与280比值大于1.8。

2. 2 胸腺素β4在大肠癌组织和正常大肠黏膜中的表达

大肠癌组织中胸腺素β4 mRNA水平显著高于正常黏膜组织（P＜0.01），部分正常黏膜组织表达缺失，正常黏膜仅有31例表达胸腺素β4 ，见图1、表1。表1 胸腺素β4 mRNA相对表达情况(n=41)A: 正常黏膜组织与大肠癌组织比较, P<0. 01 胸腺素β4 mRNA经RTPCR扩增后, 其产物电泳情况，见图1～3。被扩增片断长度是178 bp。内标基因GAPDH同时电泳作内部对照，所有组织标本均表达。

2. 3 胸腺素β4mRNA 的表达与大肠癌临床病理参数的相关性

图1 大肠癌和对应正常黏膜组织中

胸腺素β4 mRNA的表达

M为相对分子质量标准。1、3、5、7为大肠癌组织，2、4、6、8为对应正常黏膜组织，9为空白对照。每例标本均见178 bp处有胸腺素β4目标mRNA。

图2 内参照GAPDH 基因的扩增结果

1、2、3、4、5、6、7、8、9分别为上述组织对应大肠组织，每例标本均见439 bp处有GAPDH 基因的表达。

图3 大肠癌中胸腺素β4mRNA内参照

GA PDH 基因的扩增结果

1、2、3、4、5、6分别为癌组织中胸腺素β4 mRNA内参照GAPDH 基因的表达。见178 bp处有胸腺素β4 mRNA阳性表达和439 bp处有GAPDH 基因的阳性表达。

胸腺素β4 mRNA的表达与肿瘤大小<