【摘要】 目的 探讨大肠癌耐药基因P糖蛋白（Pgp）、谷胱甘肽s转移酶（GSTπ）、拓扑异构酶Ⅱ（TOpoⅡ）、胸苷酸合成酶（TS）的表达及其与临床预后的关系。方法 应用免疫组织化学方法检测71例大肠癌中Pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS的表达。结果 Pgp的表达与肿瘤组织类型、UICC分期有关（P＜005），与肿瘤浸润深度及淋巴结转移无关；TOpoⅡ的表达与肿瘤侵犯深度、淋巴结转移有关（P＜005），与肿瘤组织类型、UICC分期无关；GSTπ的表达与各个指标之间均相关（P＜005）；TS的表达与组织类型、淋巴结转移、UICC分期有关（P＜005），与肿瘤侵犯深度无关。经多因素Cox比例风险模型分析显示：UICC分期、肿瘤组织类型及TOPOⅡ、GSTπ的表达与大肠癌患者术后生存率有关（PS＜005）。结论 大肠癌中Pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS的检测对肿瘤化疗药物的选择具有重要意义；UICC分期、组织类型及TOpoⅡ、GSTπ的表达可作为大肠癌患者独立的预后因素。

【关键词】 大肠癌；多药耐药；免疫组化；预后

肿瘤的化疗是治疗多种肿瘤的主要辅助手段，同时也是丧失手术治疗机会的肿瘤的主要治疗手段，能够降低患者术后的局部复发和远处转移率，但部分肿瘤的耐药往往导致治疗失败。目前研究表明肿瘤耐药机制主要有以下几个方面：一是肿瘤细胞内多药耐药基因（MDR1）及其表达产物P糖蛋白（Pgp）介导的多药耐药现象，称为典型多药耐药；二是由拓扑异构酶Ⅱ（TOpoⅡ）介导的，称为非典型多药耐药；三是谷胱甘肽s转移酶（GSTπ）的表达；四是胸苷酸合成酶（TS）的表达〔1～3〕。本研究利用免疫组织化学方法探讨大肠肿瘤中上述几种耐药基因蛋白的表达与肿瘤的临床病理特征、术后生存之间的关系，为今后临床大肠肿瘤的化疗用药和患者预后的判断提供可靠的依据。

1 材料与方法

11 一般资料 收集住院临床病理资料齐全，并有10年以上随访结果的大肠癌患者71例（死亡病例均死于肿瘤相关病变），全部为原发大肠腺癌，均进行了大肠癌手术治疗，未作术后化疗、放疗等辅助治疗。男41例，女30例，年龄34～69岁（平均60岁）。结肠癌45例，直肠癌26例。癌组织侵及黏膜及黏膜下4例，侵及肌层36例，侵及浆膜或浆膜外31例。无淋巴结转移21例，1～5枚淋巴结转移30例，5枚以上淋巴结转移20例。根据国际抗癌联盟（UICC）的TNM分期标准进行临床分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期26例，Ⅲ期36例，Ⅳ期4例。高分化腺癌8例，中分化腺癌52例，低分化腺癌8例，黏液腺癌3例。

12 免疫组织化学 所有标本经10%甲醛常规固定,石蜡包埋,4 μm连续切片。所有试剂均为Dako公司产品，Pgp(单克隆抗体,稀释浓度1∶50)、TOpoⅡ(单克隆抗体,稀释浓度1∶100)、GSTπ(单克隆抗体,稀释浓度1∶50)、TS(单克隆抗体,稀释浓度1∶50)，染色参照试剂说明书严格操作。主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗（采用专用微波炉进行抗原微波热修复），正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗 、三抗各1 h，DAB显色10～15 min，复染核脱水透明，中性树胶封片。结果判断:着色细胞＜10%为阴性,＞10%为阳性。Pgp阳性表达定位在肿瘤细胞膜和细胞质，TOpoⅡ阳性表达定位在细胞核，GSTπ阳性物质定位在细胞质和细胞核，TS阳性物质定位在细胞质。同时采用 HIPAS100图像分析软件对所有的实验结果进行分析，每张切片随机选取5个着色典型区域且不重复的视场，测量每个视场中阳性单位，取其均数即为该切片的实验数据。

13 统计学方法 应用SPSS100统计软件进行统计学处理。不同组间表达率的比较采用Fisher精确概率法，各指标表达水平与临床病理参数之间作直线回归相关分析，对全部病例用Cox比例风险模型进行单因素和多因素生存分析，并对有预后价值的指标绘制KaplanMeier生存曲线。

2 结果

21 Pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS在各组中表达的阳性率 71例大肠癌病例中，Pgp阳性45例（633%）、TOpoⅡ阳性20例（281%）、GSTπ阳性58例（816%）、TS阳性18例（253%）。Pgp的表达率在侵犯肌层和侵犯浆膜及浆膜外两组之间有明显差别，侵犯肌层组的表达率明显低于侵犯浆膜及浆膜外组的表达率；GSTπ在高中分化腺癌的表达率明显低于在低分化腺癌、黏液腺癌中的表达率，在淋巴结转移5枚以下组的表达率明显低于淋巴结转移5枚以上组，在Ⅰ、Ⅱ期的阳性表达率明显低于Ⅲ、Ⅳ期；TS在高中分化腺癌的表达率明显低于在低分化腺癌、黏液腺癌中的表达率（表1）。

表1 Pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS在各组中表达的阳性率（略）

P代表Pgp， TO代表TopoⅡ，G代表GSTπ，T代表TS

表2 Pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS表达与临床病理参数的相关分析（略）

注：P代表Pgp，TO代表TopoⅡ，G代表GSTπ，T代表TS

22 直线回归相关分析 Pgp的表达与肿瘤组织类型、UICC分期有关（P＜005），与肿瘤浸润深度及淋巴结转移无关；TOpoⅡ的表达与肿瘤侵犯深度、淋巴结转移有关（P＜005），与肿瘤组织类型、UICC分期无关；GSTπ的表达与各个指标之间均存在相关（P＜005）；TS的表达与组织类型、淋巴结转移、UICC分期有关（P＜005），与肿瘤侵犯深度无关（表2）。

23 临床病理特征、耐药基因蛋白表达与术后生存之间的关系 见表3。对随访资料进行单因素Cox模型分析，结果显示：大肠癌组织类型、浸润深度、淋巴结转移、UICC分期及Pgp、TOpoⅡ、GSTπ的表达均与术后生存之间明显相关（P＜001）；多因素Cox模型分析结果显示：只有UICC分期、组织类型、TOpoⅡ和GSTπ的表达与术后生存时间之间存在明显相关（P＜005），即UICC分期越晚、分化程度越低、TOpoⅡ和GSTπ表达水平越高，患者的术后生存时间越短，生存率越低（表4、表5、图1～图4）。

表3 临床病理特征、耐药基因蛋白表达与术后生存之间的关系（略）

表4 大肠癌多因素生存分析（Cox比例风险模型）结果（略）

表5 大肠癌单因素生存分析（Cox比例风险模型）结果（略）

图1 大肠癌TopoⅡ表达的KaplanMeier生存曲线（生存时间单位：月）（略）

图2 大肠癌GSTπ表达的KaplanMeier生存曲线（生存时间单位：月）（略）

图3 大肠癌UICC分期的KaplanMeier生存曲线（生存时间单位：月）（略）

图4 大肠癌组织类型的KaplanMeier生存曲线（生存时间单位：月）（略）

3 讨论

化疗是大肠癌治疗的一种重要的辅助治疗手段，然而很多患者对化疗敏感性差，主要原因是肿瘤细胞对化疗药物耐药。耐药分为原发耐药和继发耐药，前者是肿瘤细胞的内在性耐药，发生于化疗后的耐药称为获得性耐药。另外肿瘤细胞对一种药物产生耐药后可能对与这种药物结构和作用机制完全不同的其他药物产生耐药，此即多药耐药（multidrug resistance，MDR），常常导致联合化疗方案的失败。我们收集的这组大肠癌患者术后生存时间存在明显差异，进行免疫组织化学染色研究后发现肿瘤耐药基因的表达也存在明显不同，因此我们对肿瘤耐药基因的研究不仅可以为临床用药提供合理依据，同时回顾研究耐药基因蛋白表达与患者预后之间的关系可以对肿瘤术后作出更加准确的判断。

目前已经发现的耐药谱明确的耐药基因共有11种，可分为药泵蛋白、药物代谢酶类、DNA修复酶、蛋白质合成限速酶等。目前公认最主要的多药耐药基因是MDR1的过度表达〔4〕。人类肿瘤的多药耐药基因家族由MDR1和MDR3组成，仅MDR1表达与肿瘤耐药性有关〔5，6〕。MDR1是编码分子量为170 KD的细胞膜糖蛋白，命名为Pgp，其功能为能量依赖性跨膜外排泵，使细胞内药物蓄积减少，从而使细胞对药物耐药，同时对不同的亲脂类药物产生交叉耐药。已有的研究表明MDR1在大肠癌、肾细胞癌、肝细胞癌中通常高水平表达，而乳腺癌、卵巢癌中出现低水平表达。Griffiths等研究显示Pgp阳性表达的结肠癌易于浸润血管和淋巴结转移〔7〕。Luneva等对随访的大肠癌患者进行研究后发现：Pgp阳性患者术后5年生存率显著低于Pgp阴性患者〔8〕。我们的实验结果Pgp阳性率633%，表达水平较高，阳性区域呈现弥散分布特点。其表达水平与肿瘤组织类型、UICC分期呈明显正相关，说明随大肠癌分化程度降低以及肿瘤发生发展进展至临床晚期，肿瘤获得Pgp耐药性；与肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况无明显相关性，经单因素和多因素Cox比例风险模型分析提示该指标对大肠癌预后无意义。因此认为Pgp对大肠癌的预后有重要影响，但其尚不能作为判断大肠癌预后的独立指标。

GSTπ是一组多功能药物代谢酶，与细胞内解毒密切相关，临床应用的许多抗肿瘤药物都可在GST催化下通过谷胱甘肽（GSH）结合而解毒。GST根据等电点的不同分为碱性、中性和酸性三种。其中酸性GST（GSTπ）是肿瘤细胞和组织中最常见的同功酶，在许多耐药细胞尤其是MDR阳性表型的细胞中高表达。GSTπ主要分布于消化道、泌尿系统和呼吸道上皮。在结肠上皮、腺瘤、结肠癌和患者血清中都可检测到GSTπ，而且其表达水平与临床分期（TNM）呈正相关。Lorico等研究发现前列腺癌中GSTπ基因的调控因子也可上调VEGF尤其是VEGFC的表达，而VEGFC与肿瘤组织中的新脉管尤其淋巴管的形成密切相关〔9，10〕。我们的实验