【摘要】 目的 研究MMP9和VEGF在结肠癌中的表达及其与血管生成、侵袭转移之间的关系，探讨MMP9与VEGF之间的相关性。方法 采用免疫组化SP法，对44例结肠癌和5例正常结肠组织做MMP9、VEGF、第Ⅷ因子、Ⅳ型胶原的抗原标记。结果 MMP9、VEGF表达阳性的结肠癌组织MVD值明显高于表达阴性者（P<0.01）； MMP9、VEGF的表达与淋巴结转移、组织学分型、Duke's分期有明显相关（P<0.01或P<0.05）；MMP9与VEGF在结肠癌的表达无相关性。结论 MMP9和VEGF的表达以及MVD值与结肠癌侵袭转移密切相关，可作为判断结肠癌预后的指标。

【关键词】 基质金属蛋白酶 微血管密度 血管内皮生长因子 侵袭 转移

肿瘤生长和转移依赖于血管生成，而血管生成又需多种因素协同作用[1]。本研究拟探讨结肠癌基质金属蛋白酶9（MMP9）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达与血管生成之间的相关关系，MMP9、VEGF的表达和微血管密度（MVD）与结肠癌各临床病理特征之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集牡丹江医学院附属医院2000～2002年资料完整的结肠癌44例，年龄28～92岁，平均63.36岁，男性22例，女性22例；Duke's分期，A期12例，B期13例，C期10例，D期9例；组织学分型，乳头状腺癌8例，管型腺癌26例，黏液型、印戒型、未分化型共10例；分化程度，高、中分化共30例，低、未分化共14例；有淋巴结转移者19例，无淋巴结转移者25例；结肠癌组织位于左侧（乙状结肠、降结肠）共36例，位于右侧（升结肠）8例；5例正常结肠组织做对照。

1.2 试剂和方法

所有标本均用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，采用免疫组化SP法检测。VEGF用高温煮沸法行EDTA液抗原修复；FⅧ用胃蛋白酶行抗原修复；Collagen Ⅳ用胰蛋白酶行抗原修复。四种抗体均为鼠抗人单克隆浓缩型抗体，以1∶40的比例稀释，美国NeoMarker公司生产，购于福建迈新生物公司；PBS液替代第一抗体作空白对照。

1.3 结果判断

MMP9、VEGF以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，400倍下计数每个视野中癌细胞总数以及MMP9、VEGF阳性的癌细胞数，结果用平均数±标准差表示。结肠癌癌细胞阳性判定标准参照：染色强度，0分为无色，1分为黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；阳性细胞所占的百分比，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为﹥76%；染色强度与阳性细胞所占的百分比的乘积﹥3分为免疫反应阳性。MVD值计数：先在低倍镜（×40）下选取癌组织间质微血管密集的部位，然后在高倍镜（×200）下进行观察，按照Weidner等[2]的评判标准进行，每例标本分别计数5个视野，由二位教师同时计数，最后取其平均值为该例的MVD值。

1.4 统计方法

采用SPSS11.0进行统计学分析，分别用χ2检验、Spearman相关分析、方差分析检验。

2 结果

2.1 免疫组化染色

MMP9、VEGF在结肠癌组织内着色于癌细胞质，呈棕黄色，癌巢周边区域较强，部分间质细胞亦阳性表达,见图1、2，正常结肠组织无表达；结肠癌MVD值较高，尤其在癌巢周边区域,见图3；在MMP9呈阳性表达的部位，可见Ⅳ型胶原呈现粗细不等的线状，伴有缺损、断裂，甚至有些区域胶原组织大片消失,见图4。 表1 MMP9、VEGF、MVD值与各临床病理因素之间的关系注:组间比较：# P＜0.05

2.2 MMP9、VEGF的表达以及MVD与结肠癌临床病理特征的关系

表1显示，MMP9和VEGF的表达与结肠癌的组织学类型、Duke's分期、淋巴结转移密切相关（P<0.01或P<0.05）；MVD值与结肠癌的分化程度、组织学类型、Duke's分期、淋巴结转移有密切相关（P <0.01或P<0.05）。表2 MMP9、VEGF与MVD之间的关系

2.3 MMP9、VEGF表达与MVD值间的关系

结肠癌组织中MMP9、VEGF表达阳性组的MVD值均显著高于表达阴性组（P <0.01，见表2）。表3 MMP9与VEGF之间的相关关系从表3可见结肠癌组织内MMP9和VEGF表达相同的有31例，但统计分析表明两者无相关性（P＞0.05）。

3 讨论

自1985年Liotta证实MMP2能降解天然的Ⅳ型胶原后，相关的研究证实MMP9也有很强的破坏肿瘤基质的作用[3]。本研究显示结肠癌组织的MMP9表达显著高于正常组织，并在MMP9表达阳性位置见Ⅳ型胶原的断裂和缺损，甚至有些区域全部缺失，此点与大多数相关的研究结论相同。另外本研究表明，MMP9的表达与Duke's分期、淋巴结转移、组织学分型关系密切，其中随着Duke's分期的升高MMP9表达的阳性率也升高，这一点与Liabakk等[3]的研究结论不同。

本研究利用抗血管内皮第Ⅷ因子单克隆抗体对结肠癌血管进行标记，使在光学显微镜下常规染色无法辨认的微血管经免疫染色标记，从而可准确地计数癌组织中单位视野内的微血管数。本研究显示结肠癌组织的MVD值与Duke's分期、淋巴结转移、分化程度、组织学分型均密切相关，其中Duke's分期的A、B、D三期之间有差异，B、C两期无差异，组织学分型的三种类型相互之间均有显著差异，认为MVD值可作为结肠癌进展和预后的参考指标。

近年的研究[4]显示MMPs有促进肿瘤血管生成的作用，此作用可能是通过清除血管外的基底膜（BM）和细胞外基质（ECM）而实现的，如Chung等[5]的研究表明，MMP9可启动血管生成，这一作用可被TIMPs抑制。本课题关于MMP9与MVD值的研究表明，MMP9表达阳性组织的MVD值显著高于表达阴性者（P <0.01），证实MMP9确实与肿瘤的血管生成关系密切。

VEGF是最强的致血管生成因子之一，主要是通过促进内皮细胞增殖而起作用[6]。本研究表明VEGF的表达与结肠癌的组织学分型、Duke's分期、淋巴结转移均密切相关，与多数同类研究结果相同。此外，VEGF表达阳性结肠癌组织的MVD值显著高于表达阴性者（P＜0.01），证实了VEGF在结肠癌中促进血管形成的作用。

肿瘤血管形成有两个关键步骤[4]，及血管BM和ECM的降解、内皮细胞增殖和迁移，MMP9和VEGF是否可协同完成这两个关键步骤呢？本研究表明，MMP9和VEGF表达相同的共有31例，但Spearman相关分析表明两者的表达无相关性，见表3，不同于Riedel等[7]的研究。说明在结肠癌血管生成过程中，虽然多数情况下有MMP9和VEGF的作用，但同时还有其他复杂因素的参与，具体作用机制有待于进一步研究。

上述研究表明，MMP9、VEGF的表达和MVD值可作为结肠癌判断预后的参考指标。

（本文图见封3）

【参考文献】
［1］ Holash J，Maisonpierre PC，Compton D，et al.Vessel cooption，Regression，and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF[J].Science,1999,284（5422）：19941998.

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[3] Liabakk NB，Talbot I，Smith RA，et al.MMP2 and MMP9 type collagenases in colorectal cancer [J]. Cancer Res,1996,56(1) ：190196.

[4] Chambers AF，Matrisian LM.Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis [J]. J Natl Cancer Inst,1997,89(17)；12601270.

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[6] Sato Y，Abc M，Tanaka K，et al.Signal transduction and transcriptional regulation of angiogenesis [J].Adv Exp Med Biol,2000,476：109115.

[7] Riedel F，Gotte K，Schwalb J，et al .Expression of 92kDa type Ⅳ collagenase corrclatcs with angiogenic markers and poor survival in head and neck squamous cell carcinoma [J] .Int J Oncol,2000,17（6）：10991105.