【摘要】 目的 研究抗凋亡基因bag1和bcl2在结肠癌组织中的表达及意义，并探讨二者之间的关系。方法 应用免疫组织化学SABC法对64例结肠癌组织及10例正常结肠组织中bag1和bcl2基因的表达进行检测。结果 结肠癌组织中bag1和bcl2蛋白阳性表达率分别为64.1%和70.3%，显著高于结肠正常组织10.0%（P<0.05）；bag1和bcl2在结肠癌中的表达与结肠癌病理类型无关，但bag1与病理分级密切相关（P<0.05），而bcl2与病理分级无明显相关性（P>0.05）；抗凋亡基因bag1和bcl2在结肠癌的发生发展过程中呈正相关，r＝0.475。结论 结肠癌组织中有不同水平的bag1和bcl2蛋白的高表达，两者相互作用并通过调节细胞凋亡而参与结肠癌的发生、发展，它们可以作为结肠癌早期筛选的一项指标，并对疾病的预后有着重要意义。

【关键词】 结肠癌 bag1 bcl2 细胞凋亡

0 引言

结肠癌是人类胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，且其发病率有逐年上升的趋势。细胞凋亡障碍是肿瘤发生的重要机制之一，目前的研究表明，凋亡是一个多受基因控制的过程［1］。bag1是最近才发现的一种多功能结合蛋白，它具有与抗凋亡基因bcl2相互结合，相互影响，从而促进细胞抗凋亡的能力［14］，抗凋亡基因bag1在肿瘤发生发展中的作用正成为国内外研究的热点问题之一，但目前国内关于它在胃肠道肿瘤发病中作用的研究尚未见有关报道。在本研究中我们采用免疫组织化学研究了64例结肠癌中bag1和bcl2的表达情况，并就其临床意义及相互关系作了初步探讨。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2001～2003年手术切除的结肠癌石蜡包埋组织块64例，均来自协和医院病理科存档标本，标本均经过4%多聚甲醛灌注固定，常规石蜡包埋连续切片，厚约5μm。病人年龄范围为35～67岁。按WHO病理分级，腺癌46例，粘液癌10例，未分化癌8例。其中高分化腺癌18例，中分化18例，低分化10例。同时选择10例正常结肠组织石蜡标本作对照。

1.2 方法 兔抗人多克隆bag1抗体为美国Santa Cruz公司产品。兔抗人bcl2抗体和SABC免疫试剂盒购自北京中山生物制品公司。采用SABC法测定bag1和bcl2的表达，抗bag1的工作浓度1∶50，生物素化单抗和SABC试剂的工作浓度均为1∶100。石蜡组织连续切片5μm，载玻片防脱片处理，常规脱蜡至水。石蜡切片经热抗原修复，滴加正常山羊血清封闭过夜，室温20min，甩去多余液体，滴加1∶50抗bag1或bcl2抗体，4℃敷育过夜，次日滴加生物素化山羊抗兔IgG，20℃～37℃20min，再滴加SABC试剂，20℃～37℃20min，PBS 5min×4次，DAB室温显色20 min，苏木素复染，脱水，透明，封片。以PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性反应片作阳性对照。

1.3 判定标准 bag1和bcl2皆以胞质、胞核棕黄色为阳性。在10×40倍光镜下随机观察5个视野，计算其平均数，每个视野计数100个细胞。bag1阳性细胞占肿瘤细胞数<10%为低表达（+），10%～30%为中度表达（++），>30%为高表达（+++）。bcl2阳性细胞占肿瘤细胞数<30为低表达（+），30%～50%为中度表达（++），>50%为高表达（+++）。

1.4 统计学方法 阳性表达率比较用χ2检验，bag1与bcl2的关系采用相关系数（r）分析。

2 结果

2.1 bag1和bcl2在结肠癌组织中的表达

2.1.1 bag1的表达 bag1在结肠癌组织的免疫组化染色分为不表达、胞质表达、胞核表达和在二者同时表达四种形式。大部分表达在胞核，小部分表达在胞质，呈棕黄色颗粒，染色强弱不等。bag1在10例正常组织中只有1例阳性表达，阳性率为10%，在结肠癌组织中的阳性表达有41例，阳性率为61.4%，二者有显著性差异（P<0.05），见图1、图2、图5。

2.1.2 bcl2的表达 bcl2蛋白的表达部位主要在细胞核或胞质，成灶状或弥漫状分布。在10例结肠正常组织中，bcl2蛋白阳性表达1例，阳性率为10%，主要在胞核成灶性分布。在64例结肠癌组织标本中，bcl2蛋白表达阳性45例，阳性率为70.3%，在胞核或胞浆内呈灶状或弥漫分布的棕黄色颗粒。在结肠癌组织中bcl2蛋白表达明显高于正常组织，二者有显著差异（P<0.05），见图3、图4、图6。

2.2 bag1与Bcl1表达与病理类型的关系 bag1蛋白在46例腺癌中有29例阳性表达，阳性率为63.0%；在10例粘液癌中有7例阳性表达，阳性率为70.0%；在8例未分化癌中阳性表达有5例，阳性率为62.5%。经χ2检验，P>0.05，三者之间无显著差异。bcl2蛋白在腺癌中有32例阳性表达，阳性率为71.1%，在粘液癌中有8例阳性表达，阳性率为80.0%，在未分化癌中，阳性5例，阳性率62.5%。经χ2检验，P>0.05，三者之间无显著差异，见表1。

表1 bag1和bcl2蛋白表达与结肠癌临床病理特征之间的关系（略）

2.3 bag1和bcl2的表达与结肠癌病理分级的关系 在18例高分化、18例中分化和10例低分化腺癌中，bag1蛋白分别有6例、14例和9例阳性表达，其阳性表达率用χ2检验进行比较P<0.05，三者之间有显著性差异。在相应的高、中、低分化腺癌标本中，bcl2的阳性表达结果经χ2检验P>0.05，三者之间无显著差异，见表1。

2.4 bag1和bcl2表达的相互关系 在64例结肠癌标本中，bag1、 bcl2共同阳性表达的有27例，共同阴性表达的有7例，通过对64例结肠癌标本中bag1与bcl2蛋白的平均阳性表达数进行相关系数分析，r＝0.475，二者成正相关。

3 讨论

bag1基因是Takayama等1985的首先报道的一种抗凋亡基因，其分泌蛋白是一种已经被确认的多功能结合蛋白，它不属于bcl2家族成员，但可与之相互结合，相互作用，增强其抗凋亡的能力［14］。bag1在正常组织中几乎不表达，而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌及胃肠道恶性肿瘤中都有阳性表达［5，6］。ShouChing Tang［1］认为bag1蛋白可以作为乳腺癌发病机理中的一种分子标记，并可作为影响乳腺癌预后的一项独立预后因素。Kikuchi等［7，8］的实验表明在结肠癌标本中bag1在细胞核表达阳性的病人中，其伴有远处转移的比率要高于胞核表达阴性的病人，且其5年生存率要明显低于其他病人。本实验结果表明，bag1在结肠癌组织中的阳性表达明显高于正常组织，且bag1蛋白在结肠癌细胞的胞质和胞核都有阳性表达，这可能是由于bag1 mRNA在翻译起始过程中产生两种主要的蛋白，其中短的蛋白分子（bag1S）主要是存在于细胞质中，而长的蛋白分子（bag1L）则主要定位于胞核，而本试验所用的多克隆bag1抗体可以同时作用于这两种形式的bag1蛋白分子［7］。bag1的表达与结肠癌组织的细胞类型无关，而与结肠癌的病理分级密切相关，病理分级越高，其阳性表达率也越高，说明bag1在肿瘤的发生及发展过程中都起着重要的作用，对bag1的深入研究可能对结肠癌的早期诊断及预后产生深远的影响。

bcl2是一种抗凋亡基因，其通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤的发生，在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤研究中，bcl2与肿瘤的分级、分期及预后无关［10，11］。但国外国内也有部分研究认为bcl2的表达与肿瘤的分级、分期及预后有关，这可能是应用了不同的免疫组织化学方法，不同的抗体及各地的实验室条件不同所导致。同时一些研究也认为bcl2的表达是一些肿瘤产生耐药的机制之一［9］。本实验结果表明，bcl2在各种细胞类型及病理分级的结肠癌组织中阳性表达率都很高，其间无显著差异，说明bcl2的表达与结肠癌的细胞类型及病理分级没有明显相关性，bcl2可能参与了结肠癌的发生过程，但可能与肿瘤的发展分化无关。

bag1基因是一个正调节bcl2抗细胞凋亡的蛋白，bag1基因并非bcl2家族成员的同源物，但其启动子区与bcl2具有高度同源性，两者可以形成复合物，并相互作用，从而增强细胞抗凋亡的能力，其作用机制也许与影响蛋白质的稳定性有关［3，9，11］。

本研究发现，在结肠癌组织中，bag1与bcl2的阳性表达成正相关，表明结肠癌的发生发展是由多基因调控的，其中bag1与bcl2基因在其发病过程中发挥着重要作用，且它们之间具有相互增强的作用。研究探索它们在结肠癌发生发展过程中的作用，对结肠癌的早期诊断和指导治疗有着重要的意义。

(本文图见第214页)（略）

【参考文献】
［1］ ShouChing Tang. Bag1, An antiapoptotic tumour marker［J］. IUMBM Life, 2002, 53(2): 99105.

［2］Townsend PA, Cutress RI, Sharp A, et al. BAG1: a multifunctional regulator of cell growth and survival［J］. Biochim Biophys Acta, 2003, 1603(2): 8398.

［3］Ito Y, Yoshida H, Nakano K, et al. Bag1 expression in thyroid neoplasm: its correlation with Bcl2 expression and carcinoma dedifferentiation［J］. Anticancer Res, 2003, 23(1B): 569576.

［4］Cutress RI, Townsend PA, Brimmell M, et al. BAG1 expression and function in human cancer［J］. Br J Cancer, 2002, 87(8): 834839.

［5］Turner BC, Krajewski S, Krajewsk