【摘要】 目的 研究细胞周期蛋白E（CyclinE）和增殖细胞核抗原（PCNA）在结肠癌组织中的表达及二者之间的关系。方法 采用原位杂交法和免疫组化SP法，对40例结肠癌、10例结肠腺瘤和10例结肠正常黏膜组织进行CyclinE mRNA和PCNA的检测。结果 结肠癌组织中CyclinE mRNA的阳性表达率为625%，PCNA指数为(5009±1115)，均显著高于结肠腺瘤和结肠正常组织（P＜005）；CyclinE mRNA表达阳性组的PCNA指数明显高于CyclinE mRNA阴性组（P＜005）；CyclinE mRNA与肿瘤的浸润深度、有无淋巴结转移密切相关（P＜005），与肿瘤的分化程度、有无肝转移不相关（P＞005）；PCNA与肿瘤的浸润深度、分化程度及有无淋巴结转移密切相关（P＜005），与有无肝转移无明显相关（P＞005）。结论 CyclinE可作为结肠癌的又一细胞增殖指标，其对结肠癌的发生、发展起重要作用。

【关键词】 结肠肿瘤 原位杂交 免疫组织化学 细胞周期蛋白E 增殖细胞核抗原

细胞周期蛋白(Cyclins)是一个与细胞周期相关的核蛋白家族，其中细胞周期蛋白E（CyclinE）是近几年才被确定的原癌基因，它属G1期的正调节因子，通过促进G1期至S期的转变起到调节组织细胞增殖的作用。研究发现，在多种肿瘤中均有CyclinE基因扩增和/或表达增强，但目前国内尚未见人结肠癌中CyclinE基因扩增的报道。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一种仅在增殖细胞中合成和表达的多肽，现已用于多种恶性肿瘤的研究，近年来已成为一项评估细胞增殖状态的良好指标。本研究采用原位杂交方法检测CyclinE mRNA在结肠癌组织中的表达情况，并与PCNA免疫组化的结果进行相关分析，探讨CyclinE mRNA与细胞增殖活性的关系及其在结肠癌发生、发展过程中所起的作用。

1 材料与方法

11 材料 选取2002年7月～2004年11月手术切除结肠癌标本40例，男24例，女16例，年龄24～86岁，平均（584±1725）岁。同时取电子肠镜活检结肠腺瘤10例及正常结肠黏膜组织10例。取材后用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成5 μm切片。全部病例均经术后病理学检查证实，并有完整的临床资料，手术前接受化疗或放疗病人不在本研究范围内。

12 试剂 CyclinE原位杂交检测试剂盒（内含地高辛标记的CyclinE mRNA特异探针），购自武汉博士德生物公司；鼠抗人PCNA单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色盒均为福州迈新生物公司产品；其他试剂由山东省普外科重点实验室提供。

13 原位杂交 石蜡切片常规脱蜡至水；3%H2O2室温下处理10 min；滴加3%柠檬酸新鲜配制的胃蛋白酶50 μl，37℃消化16 min左右，以暴露CyclinE mRNA核酸片段；滴加预杂交液，恒温箱37℃预杂交2 h；滴加地高辛标记的杂交液，37℃恒温箱过夜；次日37℃水温2×SSC洗涤5 min×2次，05×SSC洗涤15 min×2次,02×SSC洗涤15 min×2次；依次滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶；DAB显色；1%苏木精复染；逐级酒精脱水、二甲苯透明、封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS替代杂交液作为阴性对照。

14 免疫组织化学染色 采用过氧化物酶SP法。步骤如下：石蜡切片脱蜡至水；3%H2O2室温下孵育15 min；抗原微波修复；10%正常羊血清封闭；滴加一抗PCNA，4℃过夜；依次滴加生物素标记的羊抗鼠二抗、辣根过氧化酶标记的三抗链霉卵白素；DAB显色；复染、1%盐酸酒精分化；酒精脱水、二甲苯透明、封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS替代一抗作为阴性对照。

15 结果判定 CyclinE mRNA主要为细胞浆着色，以细胞浆内出现棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞，不着色为阴性细胞，阳性细胞数超过观察细胞总数的5%为阳性染色片。PCNA以细胞核被染成棕黄色或棕褐色为阳性细胞，先在低倍镜下选择有代表性的区域，在高倍镜下(400×)计数1000个肿瘤细胞，其中阳性细胞个数与细胞总数的百分比记作PCNA标记指数（PCNA labelling index，PCNA LI）〔1〕。

16 统计学处理 采用SAS612统计软件包，进行χ2检验、Fisher精确检验、t检验。

2 结果

21 CyclinE mRNA、PCNA在不同结肠组织中的表达 原位杂交法显示CyclinE mRNA主要定位于结肠腺瘤和结肠癌细胞的细胞浆中（图1），而在正常结肠黏膜细胞中未见明显表达。结肠腺瘤中CyclinE mRNA的阳性表达率为20%（2/10），与正常组织间无显著性差异（P＞005）。结肠癌组织中CyclinE mRNA的阳性表达率为625%（25/40），显著高于结肠腺瘤组织和正常组织（P＜005）。PCNA在结肠正常黏膜组织中偶见阳性表达（PCNA LI 693±301），随着组织学改变的进展，PCNA阳性指数呈递增趋势：（693±301）～（2491±440）～(5009±1115),各组间存在明显统计学差异（P≤0001）（见图2）。

图1 CyclinE mRNA在结肠癌中的阳性表达（400×）（略）

图2 PCNA在结肠低分化腺癌中的阳性表达（400×）（略）

22 CyclinE mRNA、PCNA的表达与结肠癌临床病理特征的关系 见表1。CyclinE mRNA和PCNA的表达均与患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径无关（P＞005）。在不同分化程度的结肠癌组织中，CyclinE mRNA的阳性表达率无显著性差异（P＞005），但PCNA的阳性表达率与组织分化程度关系密切，低分化组的阳性表达率显著高于高、中分化组的阳性率（P＜005）。CyclinE mRNA和PCNA的表达与肿瘤的浸润深度、有无淋巴结转移密切相关（P＜005），但与肿瘤有无肝转移不相关（P＞005），这可能是由于有肝转移的患者较少的缘故，但是仍较无肝转移者有升高的趋势。

表1 CyclinE mRNA、PCNA的表达与结肠癌临床病理特征的关系（略）

23 CyclinE mRNA与PCNA在结肠癌组织中表达的相关性 CyclinE mRNA表达阳性组中PCNA指数(6063±635)明显高于CyclinE mRNA阴性组的PCNA指数(4307±657)（P＜005），二者呈显著正相关（t=3742,P=001）。

3 讨论

CyclinsCDKsCKIs调控系统可能在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，在绝大多数肿瘤细胞中都存在着若干细胞周期调控基因的改变〔2〕。目前发现的Cyclin家族成员可分为10大类：A～J，包括亚型共15种，其中CyclinE是参与细胞周期G1/S转换的重要正性调节因子。CyclinE是一种核蛋白，于1991年美国学者Koff等〔3〕 从酿酒酵母菌中提取。CyclinE在细胞周期中呈现明显的周期性表达，其峰值处在G1/S期转换时，它可控制细胞进入S期，可能是G1/S期转换的限速因子。在正常情况下，CyclinE的表达是有顺序、按计划进行的。异常情况下，CyclinE由于无顺序、无计划的过度表达而存在于整个细胞周期中，它可在整个细胞周期中激活CDK2，使底物Rb磷酸化，进而使细胞超越某些控制发生异常增殖〔4〕。Mussman等〔5〕实验表明，CyclinE高表达可缩短G1期，引起中心体过增殖，干扰有丝分裂，形成不稳定的染色体，从而诱发肿瘤形成。据文献报道，CyclinE在多种恶性肿瘤中（胃癌、乳腺癌、大肠癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌、恶性淋巴瘤等）呈过度表达，且与肿瘤恶性程度及预后有关，已被证明是一种癌基因，具有早期诊断和预后判断价值。

本研究利用原位杂交技术测定CyclinE mRNA在结肠癌中的表达，其阳性表达率较文献报道〔6〕的阳性率低，原因可能是：① 本研究选择的病例主要为高、中分化型肿瘤，低分化型病例数较少；② 在判定阳性染色片时比较严格，只有阳性细胞数所占的百分数超过5%才能定为阳性染色片。在CyclinE mRNA的表达与结肠癌临床病理特征的关系方面，结果显示：CyclinE mRNA与肿瘤的浸润深度、有无淋巴结转移密切相关（P＜005），但与肿瘤的分化程度、有无肝转移不相关（P＞005）。提示CyclinE mRNA参与了癌细胞的浸润和转移机制，检测CyclinE mRNA的表达水平对于判断结肠癌的恶性程度和预后有一定的应用价值。

肿瘤细胞的增殖活性是决定肿瘤生物学行为的一个重要指标，其对于肿瘤的诊断和鉴别诊断、肿瘤的治疗和预防均有重要的参考意义。PCNA是一种评估细胞增殖状态的有效标记物，我们用免疫组化方法检测PCNA在结肠癌组织中的表达，结果显示肿瘤组织的PCNA指数与腺瘤组织、正常组织相比均具有显著性差异（P＜005），PCNA与肿瘤的浸润深度、组织分化程度及有无淋巴结转移密切相关（P＜005），与相关文献报道〔7〕一致。本实验对CyclinE mRNA与PCNA的相关性分析结果表明，CyclinE mRNA与PCNA有密切相关性，CyclinE mRNA阳性结肠癌的PCNA指数显著高于CyclinE mRNA阴性结肠癌的PCNA指数（P＜005）,提示CyclinE可作为结肠癌的又一细胞增殖指标，对术后结肠癌的石蜡包埋组织块进行联合检测CyclinE和PCNA表达水平，有助于判断结肠癌患者的预后及治疗方案的选择。

综上，CyclinE mRNA在结肠癌组织中表达显著上调，并与细胞增殖活性的关系十分密切。若将二者结合起来研究，对阐明肠肿瘤的发病机制，及肠肿瘤的预后评估和治疗方案的制定都有重要的意义，而CyclinE亦可成为肠肿瘤基因治疗的新的靶点。

【参考文献】
1 戴 林，张学庸增殖细胞核抗原与胃癌〔J